Основные методы взятия гистологического материала, фиксации и декальцинации.
Взятие материала
При микроскопическом исследовании тканей и органов большое значение имеет техника взятия материала. Соблюдение приведенных правил взятия материала позволит уменьшить количество артефактов и ошибок при гистологическом исследовании.
1. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Пользоваться ножницами во избежание размятия тканей не рекомендуется. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.
2. Кусочки вырезают толщиной 0,5-1 см, длина и ширина может быть различной (обычно 1 х 1,5 см) с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился под стандартное покровное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани взятие на исследование более толстых кусочков не рекомендуется.
3. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией.
Фиксация материала
Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур и их уплотнение. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования (например, при необходимости выявления гликогена объекты следует фиксировать не в формалине, а в этаноле). Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее, чем в 10 раз. При этом следят, чтобы кусочки в растворе не слипались и не прилегали ко дну банки. Охлаждение фиксируемых в формалине объектов нежелательно, т.к. при этом замедляется проникновение фиксатора в ткани.
Формалин
Формалин наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому может применяться для фиксации довольно крупных объектов. После фиксации в формалине объекты могут быть залиты в парафин, целлоидин или порезаны на замораживающем микротоме. Большим достоинством формалина как фиксатора является возможность сохранения в нем кусочков в течение длительного времени после завершения фиксации. Недостатком формалина является ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении влажного архива.
Этанол
Для фиксации тканей применяют как 96%-й, так и абсолютный этиловый спирт, а также различные смеси этанола и формалина. В практической работе следует применять этанол при фиксации нервной ткани для окраски по Нисслю и при планировании выявления гликогена. Лучшие результаты дает спиртовая фиксация в сравнении с формалиновой и при выявлении железа, бактерий, амилоида. По сравнению с формалином спирт обладает меньшей проникающей способностью, поэтому кусочки для фиксации берут не толще 0,5 см. Продолжительность фиксации от нескольких часов до суток.
Сложные фиксирующие жидкости:
В практической работе обычно сложные фиксирующие жидкости не используются, однако в исследовательской работе им часто отдают предпочтение перед формалином и этанолом в связи с более высоким качеством фиксации отдельных клеточных и тканевых структур, меньшим числом артефактов фиксации и лучшим сохранением тинкториальных свойств тканей.
Цинк-формалиновый фиксатор
Этот фиксатор обычно применяют для иммуногистохимических исследований, поскольку он хорошо сохраняет белки, ассоциированные с клеточными мембранами. Фиксатор готовят, растворяя в 2 л дистиллированной воды 50 г хлорида цинка и добавляя 300 мл концентрированного раствора формальдегида и 1.9 мл ледяной уксусной кислоты. Продолжительность фиксации не более 24 ч при комнатной температуре.
Жидкость Буэна
Жидкость Буена хорошо фиксирует все ткани, кроме тканей почки, не приводит к значительному сжатию и деформации рыхлых тканей и поэтому часто используется в экспериментальных и эмбриологических исследованиях. Фиксатор готовится ex tempore из насыщенного (1,2%) водного раствора пикриновой кислоты, концентрированного формальдегида (40%) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15:5:1. Продолжительность фиксации около 24 ч при комнатной температуре.
Жидкость Карнуа
Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится не более, чем за 1 час до начала фиксации. Состоит фиксатор из абсолютного спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях: 6:3:1. При фиксации в жидкости Карнуа кусочки следует вырезать толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 - 4 часа.
Декальцинация костной ткани
Декальцинацию проводят после полной фиксации ткани, при этом необходима последующая тщательная промывка материала (1-3 ч) в слабощелочных растворах. Декальцинирующая жидкость состоит из 100 мл 90% муравьиной кислоты, 80 мл 38,8% соляной кислоты (удельный вес 1,19) и 820 мл дистиллированной или водопроводной воды. Объем декальцинирующей жидкости должен значительно превышать объем декальцинируемого объекта (в 10-20 раз). Небольшие кусочки компактной кости (1 - 2 г) декальцинируются при температуре 24 ºС за 12 - 24 ч.
