Основы иммуногистохимических исследований.
Иммуногистоцитохимия – метод идентификации и определения локализации в клетке и тканях различных структур, имеющих антигенные свойства, основанный на реакции антиген-антитело.
Иммуногистоцитохимия является высокотехнологичным методическим дополнением к традиционным гистологическим методам исследования в клинической диагностике.
Так как в настоящее время стало доступным большое количество поли- и моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью и авидностью, количество прикладных задач, для решения которых могут использоваться методы ИГХ, стало практически неограниченным.
Эти методы широко используются для:
- дифференциальной диагностики опухолей, определения источника метастаза при неясном очаге опухоли, оценки гормонального статуса опухоли, иммунофенотипирования опухолей, например, опухолей лимфоидной системы, определения факторов прогноза опухолевого процесса;
- идентификации различных микроорганизмов (бактерий, вирусов);
- определения гормонов и их рецепторов и т.д.
Принцип метода
Основой ИГХ-метода является иммунологическая реакция антигена и антитела. ИГХ-методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам.
Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований:
• структурных компонентов клетки;
• рецепторов клеточной поверхности;
• клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов).
Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток:
• флуоресцентные красители;
• ферментные метки;
• металлы;
• металлопротеины;
• радиоизотопы.
Моноклональные антитела получают методом гибридомной технологии. Несмотря на то, что их получение многоэтапное и сложное, они, являются высокоспецифичными и высокоавидными антителами и направлены к одному эпитопу антигена.
Поликлональные антисыворотки, получаемые при иммунизации животных, содержат АТ к различным эпитопам антигена (АГ). Для получения поликлональной антисыворотки лабораторному животному вводят очищенный АГ вместе с неспецифическим стимулятором иммунного ответа - адъювантом. АГ стимулирует множество В-лимфоцитов, каждый из которых дает клон плазматических клеток, продуцирующий АТ. АГ может иметь несколько эпитопов и антисыворотка содержит иммуноглобулины против каждого из них, причем каждый клон плазматических клеток способен вырабатывать АТ лишь к одному типу эпитопов.
Первичные концентрированные антитела с помощью раствора для разведения (Antibody Diluent) разводятся до рабочей концентрации. Максимальные границы разведения для каждого антитела рекомендованы производителем. Система для визуализации включает вторичные антитела, конъюгированные с ферментом.
Существует несколько наиболее часто используемых вариантов постановки ИГЦХ метода:
- прямой иммунофлюоресцентный (ИФ),
- непрямой пероксидазный.
Первоначально, визуализация тканевых антигенов иммуноферментными способами окраски проводилась прямым методом, использующим ферменты, непосредственно конъюгированные с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод позволяет использовать световой микроскоп, но является низкочувствительным.
Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с развитием непрямого способа, в котором меченые ферментом вторичные антитела связываются с первичными антителами, соединенными с антигеном. Впоследствии, появились трехэтапные методы, такие как пероксидазно-антипероксидазный метод, авидин-биотиновый комплекс и другие.
Современные системы визуализации комплекса антиген-антитело относятся к новому поколению фермент-опосредованных методов окраски и позволяют проводить иммунологические исследования с высокой специфичностью и чувствительностью при наличии только светового микроскопа.
Это делает доступным современные методы исследований даже для лабораторий, не оснащенных специальным оборудованием.
Системы визуализации имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными фермент-опосредованными методами:
- предоставляют возможность оценить иммунологический профиль и морфологические особенности клетки на одном препарате (при этом исследуемый материал может быть фиксирован различными методами и допускает длительное хранение);
- обеспечивают высокую чувствительность и специфичность иммуногистохимических исследований (например, чувствительность стрептавидин-биотинового метода системы визуализации LSAB (производства DAKO) в 8 раз превышает чувствительность авидин-биотинового комплекса, а чувтвительность системы CSA (производства DAKO) сравнима с методами молекулярной биологии и пригодна для использования в методе гибридизации in situ);
- значительно сокращают время анализа и упрощают процедуру, тем самым позволяя одновременно обрабатывать большое количество образцов;
- позволяют выявлять антигены со слабой экспрессией;
- система двойного окрашивания позволяет одновременно выявлять два различных антигена на одном препарате.
Появление системы визуализации EnVision (производства DAKO) явилось революционным моментом в истории иммуногистохимии и послужило началом для развития целой серии систем, имеющих в своей основе декстрановую технологию.
Все типы систем визуализации для светового микроскопа применимы для использования широкой гаммы первичных специфических антител, предлагаемых в разнообразии производителями.
Такая универсальность систем позволяет использовать их в:
• иммунофенотипировании клеток крови и тканей;
• оценке их функционального состояния;
• диагностике патологических изменений, в том числе онкологических и выявлении инфекционного поражения клеток.
Системы визуализации могут быть использованы для исследований на парафиновых срезах, мазках, криосрезах, отпечатках и в препаратах, полученных центрифугированием клеточных суспензий. Возможность выбора субстрата позволяет получать различную окраску препаратов.
Требования к оборудованию.
Для получения гистологических препаратов с целью проведения ИГХ-исследований необходимо традиционное гистологическое оборудование, позволяющее получать качественные микропрепараты: аппарат гистологической проводки материала, аппарат для заливки парафиновых блоков, микротом, микроскоп.
Дополнительное оборудование для метода ИГХ.
ИГХ-методы относятся к ручным полуколичественным микрометодам, что и определяет соответствующий набор дополнительного оборудования, необходимый для проведения метода.
А именно:
1. Батарея емкостей для депарафинизации и регидратации (емкости для окрашивания) порядка 12 шт.
2. Стеклянная посуда (колбы для буферов, стаканы, цилиндры, емкости, бутыли)
3. Контейнер с держателем термически и химически стойкий для термической обработки материала для проедения демаскировки антигена.
4. Оборудование для термической обработки:
- баня для ИГХ (до 100 град С, прецизионная)
- микроволновая печь (бытовая, мощность не менее 800 Вт)
- электроплитка (бытовая)
- скороварка (бытовая)
5. пипеточные дозаторы с набором наконечников
- малого объема 0,5 – 10 мкл
- среднего 1-50, 20-200
- большого до 1000 мкл, до 5000 мкл
6. Гидрофобный карандаш для ИГХ
7. Весы (для самостоятельного приготовления навесок солей для буферов)
8. рН-метр (для контроля рН приготовленных буферов)
9.Холодильник для хранения специфических реактивов и буферов (бытовой)
10. Термостат
Учет результатов исследования.
Для учета результатов ИГХ-исследования необходим световой микроскоп соответствующего класса. Системы архивации и анализа изображения, состоящие из светового микроскопа, цифровой фотокамеры и компьютера, позволяют сохранаять изображения полученных микропрепаратов в оцифрованном виде и подвергать его различным методам морфоанализа с помощью специализированных программ.
Тест-реагенты для проведения ИГХ-метода.
Свободные и конъюгированные антитела, системы визуализации (вторичные антитела) для светового микроскопа, дополнительные реагенты, контрольные материалы, производства:
- DAKO (Дания)
- NOVOCASTRA LABORATORIES (Великобритания)
- ABCAM (Великобритания)
- CHEMICON (США)
- PHARMINGEN (США)
- SIGMA
