Выявление микобактерий туберкулеза.

Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из патологического материала (в большинстве случаев - мокроты). При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.

Использование метода флотации повышает выявляемость микобактерий на 10%, но в связи с отмеченными выше недостатками этого метода, он не может быть рекомендован для широкого применения в клинико-диагностических лабораториях.

Согласно Приказу  Министерства здравоохранения РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 “Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания”: "В бактериологических лабораториях медицинских организаций субъектов Российской Федерации, оказывающих специализированную медицинскую помощь по профилю «фтизиатрия», в качестве основного диагностического микроскопического исследования рекомендуется применять методы микроскопии с окраской люминесцентными красителями, где в качестве источника излучения может использоваться ртутная лампа"

Чувствительность метода флуоресцентной микроскопии значительно выше - от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Обогащение материала для микроскопии путем обработки иммуномагнитным сорбентом, обеспечивающим концентрацию возбудителя в осадке гомогенизированной мокроты, позволяет значительно повысить эффективность метода, особенно при незначительном количестве микобактерий туберкулеза в материале. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.

Желательно также фиксировать мазок без использования высокой температуры, которая приводит к денатурации белков клеточной стенки и отрицательно влияет на качество окраски флуорохромами. Широкое распространение метода люминесцентной микроскопии сдерживается, в основном, высокой стоимостью оборудования.

Культуральный метод выявления микобактерий туберкулеза дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их колонии можно наблюдать только через 2-2,5 месяца.

Чаще всего применяется посев на твердую яично-картофельную среду Левенштайна-Йенсена, реже на среды Фин-2 и В.А. Аникина.

Диагностические возможности культурального метода ограничиваются длительным периодом роста микобактерий, а также тем, что при активном туберкулезе легких этим методом возбудитель выделяется только в 52 - 65% случаев. При внелегочном туберкулезе процент выявлений культуральным методом еще ниже. Так, например, при туберкулезном менингите рост микобактерий на питательных средах наблюдается только в 3% случаев. При нефротуберкулезе частота выявления варьирует от 26,7% до 73% случаев.

Российским НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения рекомендуется комплексная методика исследования мочи на наличие микобактерий туберкулеза. Из одной и той же порции одновременно выполняется люминесцентная микроскопия осадка, окрашенного ауромином, и посев не менее чем на две питательные среды. Микобактерии, потерявшие кислотоустойчивость, но сохранившие жизнеспособность, выявляются посевом, а потерявшие жизнеспособность, но сохранившие кислотоустойчивость - бактериоскопией.

К сожалению, широкое внедрение этой методики сдерживается, как уже было отмечено выше, высокой стоимостью лабораторного оборудования для люминесцентной микроскопии. Также существует ряд факторов, ограничивающих широкое применение культурального метода, в частности, необходимость использования дорогостоящих питательных сред.

Значительные трудности представляет обнаружение микобактерий у лиц со скудным их выделением. Это притом, что среди впервые выявленных больных у одной трети бактериовыделение бывает однократным.

За рубежом широкое распространение получила радиометрическая система Bactec, дающая возможность быстрого обнаружения микобактерий туберкулеза в жидкой питательной среде. Микобактерии культивируются в жидкой среде Bactec, где в качестве источника углерода используется меченая С14 пальмитиновая кислота. При положительных данных бактериоскопического исследования рост микобактерий обнаруживается радиометрически на 7-10 день, а при отрицательных - на 14-21 день. К недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся: высокая стоимость исследований, необходимость применения радиоактивных изотопов, специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией, необходимость дополнительного посева на плотные питательные среды при возникновении проблем с идентификацией возбудителя.

В настоящее время для культуральной диагностики туберкулеза также используется автоматизированная система MB/BacT фирмы Organon Teknika. В результате использования этой системы среднее время детекции роста микобактерий составляет 18,7 дня против 33,2 на стандартной плотной среде Левенштайна-Йенсена. К сожалению, высокая стоимость оборудования делает повсеместное внедрение этого метода в практику лабораторной диагностики туберкулеза маловероятным.

Иммуноферментный анализ (ИФА) получил широкое распространение в диагностике различных инфекционных заболеваний в связи с высокой чувствительностью и специфичностью, высокой производительностью, простотой проведения анализа и регистрации результатов, возможностью микроколичества диагностического материала и автоматизации процесса. ИФА используется для определения в биологических жидкостях, как антигенов, так и антител к этим антигенам.
 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на обнаружении участка ДНК, характерного только для данного возбудителя, может служить одним из методов экспресс-диагностики туберкулеза. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить в исследуемом материале единичные клетки или даже фрагменты ДНК возбудителя в течение 4-5 часов. Благодаря отсутствию перекрестных реакций с ДНК бактерий - возбудителей других легочных инфекций (L.pneuphila, M.pneumoniae, K.pneumoniae, Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, S.aureus, E.coli, F.tularensis), а также с ДНК человека, ПЦР обладает высокой специфичностью (100%). Чувствительность ПЦР при тестировании образцов патологического материала полученного от больных с различными формами туберкулеза легких составляет: мокроты - 63,5-80,0%, мочи - 50,0-78,8%, плевральной жидкости - 45,8-54,5% и крови - 17,2-42,8%. Моча достаточно часто служит прекрасным материалом для выявления специфической ДНК у больных с распространенным туберкулезом легких, без сопутствующего специфического процесса в почках и мочевыделительной системе. ПЦР дает возможность дифференциальной диагностики при ограниченных формах туберкулеза (очаговых инфильтратах, туберкулемах, туберкулезе внутригрудных лимфатических узлов), а также при диссеминированной форме туберкулеза, при которых дифференциальная диагностика с использованием только традиционных микробиологических методов весьма затруднена в связи с редким обнаружением возбудителя в мокроте. Обобщая результаты бактериоскопии, посева на плотные питательные среды и исследования методом ПЦР материала, полученного от больных ограниченными формами туберкулеза можно сделать вывод о том, что последняя обладает значительно более высокой чувствительностью по сравнению с традиционными методами. В частности при сравнительном исследовании одного и того же материала бактериоскопией было получено 11,2% положительных результатов, методом посева на питательные среды - 19,3%, и методом ПЦР - 51,6% таких результатов.

Практически полное совпадение результатов сравнительного исследования патологического материала микробиологическими методами и методом ПЦР отмечается только при хронических деструктивных формах туберкулеза легких: кавернозной и фиброзно-кавернозной. Такое совпадение результатов обусловлено наличием у пациентов постоянного массивного бактериовыделения, характерного для таких форм туберкулеза. ПЦР достаточно информативна при необходимости подтверждения диагноза туберкулеза у детей и подростков при отрицательных результатах традиционных микробиологических методов исследования.

Использование ПЦР в диагностике туберкулеза рекомендовано Минздравом РФ (приказ от 21.02.2000 №64 "Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований", п. 9.4.5. приложения).

Использование ПЦР раскрывает возможности проведения, параллельно с традиционным бактериологическим способом определения лекарственной резистентности, экспресс-диагностики резистентности микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам методом выявления точечных мутаций в генах. В настоящее время известны следующие гены микобактерии туберкулеза, мутации в которых вызывают резистентность к лекарственным препаратам: rpoB - к рифампицину, katG, inhA, oxyR, ahpC, kasA - к изониазиду, rpsL - к стрептомицину, gyrA - к фторхинолонам, pncA - к пиразинамиду, embCAB - к этамбутолу. При этом, в большинстве случаев, исследованные клинические изоляты, устойчивые к рифампицину, оказались резистентными и к другим противотуберкулезным препаратам. Таким образом, устойчивость к рифампицину является маркером полирезистентности.

Кроме того, последние результаты изучения спектра MDR-штаммов микобактерии туберкулеза у впервые выявленных больных можно позволяют сделать вывод о снижении показателя удельного веса штаммов, устойчивых к стрептомицину и этамбутолу, и о наличии тенденции к увеличению частоты выделения штаммов, устойчивых к изониазиду и рифампицину.

Разработанный в Институте молекулярной биологии метод определения лекарственной резистентности микобактерии туберкулеза к рифампицину на микрочипах позволяет обнаружить 30 мутантных вариантов ДНК микобактерии туберкулеза.

Использование данного метода позволило выявить резистентность к рифампицину у 64,8% больных в течение 3-х дней до начала лечения. Режим химиотерапии данной когорты больных изначально состоял из комбинации препаратов резервного ряда (канамицин, офлоксацин, этионамид, циклосерин) и пиразинамида. Спустя 3 три месяца методом абсолютных концентраций выявлена лекарственная резистентность, по крайней мере, к изониазиду и рифампицину у 34 из 35 (97,2%) пациентов данной группы.

Применение молекулярно-генетических методов в эпидемиологии позволяет провести генотипирование клинических изолятов микобактерий, выделенных от больных на определенной территории.

В частности, в Томской области молекулярно-генетическими исследованиями, проведенными Нью-Йоркским институтом общественного здравоохранения, совместно с Центральным научно-исследовательским институтом туберкулеза РАМН, установлено, что 45% всех выделенных культур микобактерий туберкулеза представлено всего двумя штаммами, один из которых является эндемичным для Томской области. Данным методом было выявлено уникальное семейство микобактерии туберкулеза KY, ранее не встречавшееся в базе данных Нью-Йоркского института, а также преобладание микобактерий W- (20 штаммов) и Al- (8 штаммов) семейств. Молекулярное типирование показало, что более 60% штаммов, выделенных от больных из учреждений УИС Ивановской области, принадлежало к W-семейству, а около 12% культур было представлено смесью штаммов микобактерий туберкулеза двух генотипов.

Выявление путей распространения возбудителей туберкулеза, основанное на методах молекулярной эпидемиологии, способствует принятию эффективных мер по предотвращению дальнейшего распространения туберкулеза в УИС и дальнейшему снижению заболеваемости.