Методика подсчета общего количества микроорганизмов.
Подсчет общего количества микроорганизмов.
Для определения количества микроорганизмов в 1 мл жидкости производят, подсчет их под микроскопом в счетной камере (Тома-Цейса, Горяева, Бюркера или Предтеченского). Счетная камера имеет вид толстого предметного стекла, в центре которого находится стеклянная пластинка с выгравированной на ней сеткой, (или 2 сетки на разделенной пополам пластинке). Справа и слева от центральной пластинки находятся 2 другие стеклянные пластинки с уровнем на 0,1 мм выше. После тщательного перемешивания исследуемой жидкости берут каплю ее сухой стеклянной палочкой или петлей, наносят на сетку счетной камеры, накрывают покровным стеклом размером 18X18 мм толщиной 0,25—0,35 мм и притирают покровное стекло к боковым пластинкам камеры. Притирают покровное стекло для того, чтобы высота слоя исследуемой жидкости в камере была 0,1 мм. Затем счетную камеру кладут на столик микроскопа и находят в его поле зрения сетку. Легче ее находить под малым увеличением (10X8). Затем, не двигая счетную камеру, делают увеличение в 400 раз (окуляр 10Хобъектив 40). При таком увеличении в поле зрения микроскопа помещается 1 большой квадрат, состоящей из 16 маленьких квадратов или не разделенный на маленькие квадраты. Подсчитывают все клетки микроорганизмов, находящиеся внутри большого квадрата, а также на пограничных линиях, если клетки большей половиной находятся в данном квадрате. Клетки, большая половина которых находится в другом квадрате, не подсчитываются. Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, то клетки считают только на двух смежных сторонах квадратов, например, на левой и нижней. В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших квадратах, например, по углам и в центре сетки. В слишком густых суспензиях считать микроорганизмы трудно, поэтому их следует разбавлять водой и пользоваться такими разведениями, при которых количество клеток в одном большом квадрате будет не более 30. Для того чтобы результат подсчета был достоверен, необходимо сосчитать не менее 600 микроорганизмов. Количество препаратов, в которых нужно подсчитать микроорганизмы, будет зависеть от количества клеток в них. Так, если в пяти больших квадратах одного препарата содержится около 150 клеток, то нужно приготовить 4 препарата, чтобы общее количество сосчитанных клеток было около 600. Объем одного большого квадрата во всех счетных камерах равен 1/250 мм3, соответственно объем 5 квадратов равен 5/250 или 1/50 мм3. Чтобы определить количество клеток в 1 мл (в 1000 мм3) исследуемого субстрата нужно среднюю сумму количества клеток в пяти больших квадратах умножить на 50 000. Число микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата (х) удобно определять по формуле:
х=а x 50000 b,
где а — средняя сумма количества подсчитанных клеток в пяти больших квадратах;
b — разведение исходной суспензии микроорганизмов;
50000 — коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 мл.
Для подсчета общего количества клеток культур дрожжей, образующих конгломераты, рекомендуется в исследуемую пробу добавлять равное количество 10%-ной серной кислоты и тщательно ее перемешивать для разъединения скоплений клеток. Подсчитывая результаты, следует учитывать разбавление вдвое раствором серной кислоты. При дифференцированном подсчете почкующихся, живых и мертвых клеток дрожжей на сетку помещают каплю исследуемой дрожжевой суспензии, добавляют каплю водного раствора метиленовой синей (1 : 10 000), перемешивают, накрывают покровным стеклом, притирают его. Через 5 мин после приготовления препарата подсчитывают отдельно количество почкующихся, живых и мертвых клеток. Подсчитывая результаты, следует учитывать разбавление вдвое метиленовой синей.
Метод дифференциации живых и мертвых организмов
Метод состоит в окрашивании препарата в флуорохромом примулином. При рассматривании препарата в люминесцентном микроскопе тела мертвых микроорганизмов люминесцируют в результате проникновения красителя внутрь клеток. Живые микроорганизмы не видны. При микроскопировании белых вин бактериологической петлей диаметром не более 2 мм помещают на предметное стекло каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина (1 : 20 000), смешивают их и накрывают покровным стеклом, на которое затем кладут каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла. При микроскопировании красных вин в связи с гашением люминесценции красным цветом вина последний необходимо устранить, что достигается созданием в препарате щелочной среды. Красный цвет вина при этом превращается в синий. Бактериологической петлей помещают на предметное стекло рядом каплю осадка вина и 2 капли раствора примулина (1 : 20000) в фосфатном буферном растворе рН 8—9. Все капли тщательно смешивают петлей и покачиванием стекла в течение 1—2 мин, накрывают покровным стеклом, на которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного, масла. Приготовленные препараты рассматривают в люминесцентном микроскопе в фиолетовой и синей видимой части спектра. Для этого пользуются светофильтрами «синий свет», «сине-зеленый свет», «белый свет» и запирающим желтым. Применяют объектив масляной иммерсии 100Х, окуляр 5х. Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и подсчитывают общее количество микроорганизмов, а затем в свете люминесценции, подсчитывая только количество мертвых клеток. В свете люминесценции- живые микроорганизмы не видны, иногда у дрожжевых клеток светится только оболочка в виде тонкого зеленого кольца. Мертвые дрожжи и бактерии в свете люминесценции светятся зеленым и желтым светом разной интенсивности. Исключение составляют уксуснокислые бактерии в красных винах, погибшие под воздействием высоких температур. В этом случае мертвые бактерии не люминесцируют, так же, как и живые. Для уточнения физиологического состояния уксуснокислых бактерий рекомендуется производить контрольное микроскопирование убитой культуры. Для этого на два предметных стекла наносят по капле осадка вина. На первом стекле готовят препарат для микроскопирования, как описано выше, для красного вина. Каплю вина на втором стекле осторожно подогревают, несколько раз проводя стекло нижней поверхностью над пламенем горелки, пока оно не станет горячим (определяется тыльной стороной кисти руки). После остывания продолжают приготовление препарата. Сравнивают микроскопическую картину в обоих препаратах. Если уксуснокислые бактерии в исследуемой пробе вина живы, то в первом препарате они не светятся, а во втором (погибшие в результате мягкого термического воздействия) ярко люминесцируют. Если бактерии в пробе вина были мертвы — в обоих препаратах микроскопическая картина будет одинаковой. Контрольное параллельное микроскопирование препаратов можно применять во всех случаях, когда определение физиологического состояния микроорганизмов затруднительно. При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разведение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 paза — для красных.
